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免疫學綜述3-臨床常用的抗原或抗體檢測方法

發布時間:2021.06.04
信息摘要:
酶聯免疫檢測是目前應用最廣泛的免疫檢測方法。該方法是將二抗標記上     酶,抗原抗體反應的特異性與酶催化底物的作用結合起來,根據酶作用底物後的     顯色顏色變化來判斷試驗結果,其敏感度可達  ng   水平。常見用於標記的酶有辣 根過氧化物酶 (HRP) 、堿性磷酸酶( AP )等。由於酶聯免疫法無需特殊的儀器, 檢測簡單,因此被廣泛應用於疾病檢測。

由於各種檢測方法中所用的抗原性狀不同,出現結果的現象也不同。最廣泛應用方法有下述幾種:

1酶聯免疫吸附試驗(ELISA 

酶聯免疫檢測是目前應用最廣泛的免疫檢測方法。該方法是將二抗標記上 酶,抗原抗體反應的特異性與酶催化底物的作用結合起來,根據酶作用底物後的 顯色顏色變化來判斷試驗結果,其敏感度可達ng 水平。常見用於標記的酶有辣 根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)等。由於酶聯免疫法無需特殊的儀器, 檢測簡單,因此被廣泛應用於疾病檢測。

常用的方法有間接法、夾心法以及BAS ELISA。間接法是先將待測的蛋白被在孔板內,然後依次加入一抗、標記了 酶的二抗和底物顯色,通過儀器(例如酶標儀)定量檢測抗原。這種方法操作簡單但由於高背景而特異性較差。目前已逐漸被夾心法取代。夾心法利用二種一抗對目標抗原進行捕獲和固定,在確保靈敏度的同時大大提高了反應的特異性。近年來,抗原的定量檢測技術也不斷推陳出新。近年來,在夾心法ELISA 的基礎上,開發了多抗原檢測試劑盒,能同時檢測微量液相樣本中多個抗原含量。這項技術的應用大大縮短了診斷的時間,提高診斷的可靠性和及時性。
2免疫熒光技術

 該法是以熒光素,如異硫氰酸熒光素羅丹明等標記抗體或抗原,以檢測標本中抗原或抗體的方法。免疫熒光技術也包括兩種基本類型,即熒光抗體染色和熒光免疫測定。

① 熒光抗體染色:是用熒光抗體浸染可能含有抗原的細胞或組織切片,若有相應抗原存在,則抗原與熒光抗體結合而使熒光素不被洗脫,在熒光顯微鏡下可見發光的物體,從而達到定位檢測目的,在基礎與臨床醫學的研究及疾病的診斷等方麵有著廣泛用途。根據熒光抗體的不同可分直接法和間接法,前者即用熒光標記的第一抗體直接檢測標本片上的抗原,如病毒及某些蛋白質成分等;後者則在未標記的相應抗體(第一抗體)處理標本片後,覆以熒光標記的抗球蛋白抗體(第二抗體),借此可檢測多種抗原與抗體。與直接法相比,間接法僅需標記一種第二抗體即可適應多種抗原抗體係統的檢測,且敏感性較高。

②  熒光免疫測定:本法與酶免疫測定一樣,可分均相和非均相法。均相法常利用熒光的某些特性,如熒光的激發、吸收、猝滅等設計試驗,無需作結合的與遊離的標記物分離。雙標記法即為均相熒光免疫測定的一種類型,檢測試劑為FITC標記的抗原和羅丹明標記的抗體,當兩種標記物標記的抗原和抗體特異性結合後使兩種熒光素靠近,由於FITC的發射光譜能被羅丹明吸收,從而使FITC的熒光明顯減弱。試驗時將可能含有抗原的標本與兩種標記物一起反應,則能與FITC標記的抗原競爭結合羅丹明標記的抗體,從而減少羅丹明對FITC發射光譜的吸收。通過FITC熒光測定可推算出標本中抗原的量,其與熒光強度成正比。非均相法限於實驗室條件、試劑和容器或載體的非特異性熒光幹擾等,應用不及ELISA廣泛。近年建立的時間分辨熒光免疫測定有很大改進,該法利用稀土金屬(銪、鋱等)的螯合物具有特長的熒光壽命,將其標記抗體並延長測定時間,以使短命的非特異性熒光衰退,從而測得均一的長壽命稀土螯合物熒光。稀土螯合物的激發光吸收峰(340nm)與熒光發射峰(613nm)之間的差別顯著,也利於排除非特異熒光的幹擾。目前已用於IgE等微量血清成分及激素和某些藥物水平的測定。
 3)沉澱反應
    可溶性抗原與相應抗體在有適量電解質存在下,出現肉眼可見的沉澱現象,稱為沉澱反應。參與反應的抗原稱沉澱原,抗體稱沉澱素。沉澱原可以是多糖、蛋白質、類脂等,由於其體積小,相對反應麵積大,故試驗時需對抗原進行稀釋,以避免後帶現象。應用較早的沉澱反應是環狀沉澱反應和絮狀沉澱反應,因其敏感性不高,已被淘汰。目前應用最多的沉澱反應是Oudin建立的凝膠(瓊脂)沉澱反應及其派生方法。
    單向瓊脂擴散 簡稱單擴,將特異性抗體與熔化的瓊脂混合均勻,使抗體均勻分布於瓊脂,然後澆製成瓊脂板,再按一定要求打孔並加入抗原,使抗原向孔周自由擴散,與板中的抗體形成沉澱圈。本法為定量試驗,沉澱圈的直徑與抗原濃度成正比。單擴常用於血清中免疫球蛋白、AFP等的定量測定。
     火箭電泳 若在單向瓊脂擴散基礎上,加入抗原後,將瓊脂板置電場中,使抗原置於負極即向正極定向擴散,在與板中的抗體結合而形成錐形沉澱峰,形似火箭,故名火箭電泳。沉澱峰的高度與抗原濃度成正比。由於在電場作用下,促使帶負電荷多的抗原泳動,故火箭電泳需時短,可用於快速測定抗原含量,如在標本中加入少量同位素標記的抗原後,可作放射免疫自顯影,能檢出微量抗原。應用範圍與單擴相似。
    ③ 雙向瓊脂擴散   簡稱雙擴,先製備瓊脂板,再按要求打孔並分別加入抗原和抗體,使兩者同時在瓊脂板上擴散,若兩者對應且比例合適,則在抗原和抗體兩孔之間形成白色沉澱線。一對相應的抗原抗體隻形成一條沉澱線,因此可根據沉澱線的數目推斷待測抗原液中有多少種抗原成分;根據沉澱線的吻合、相切或交叉形狀,可鑒定兩種抗原是完全相同、部分相同還是完全不同。

④ 對流免疫電泳  若在雙擴基礎上加電泳,將抗原孔置負極端,抗體孔置正極端。由於抗原所帶的負電荷較抗體多,且抗原分子小於抗體,在電場中能夠克服電滲的作用而由負極泳向正極;抗體卻克服不了電滲作用,從正極向負極移動,二者形成對流,並在比例適宜處形成白色沉澱線,稱為對流電泳。因抗原抗體皆作定向運動,所以敏感性較雙擴為高。
    除上述方法外還有多種免疫沉澱分析技術,如區帶電泳和雙擴相結合的免疫電泳、區帶電泳與火箭電泳聯用的交叉免疫電泳,及免疫選擇電泳、免疫固定電泳等,分別應用於複雜抗原成分的分析和骨髓瘤、冷球蛋白血症等臨床疾病的輔助診斷。隨著精密儀器的研製成功,最近又建立了散射比濁、速率散射比濁等方法,使沉澱反應技術更加敏感、精確和自動化。

4) 凝集反應

細菌、紅細胞或表麵帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆粒抗原,當與相應抗體結合,抗原與抗體結合形成凝集團塊,即稱為凝集反應。

直接凝集  是將細菌或紅細胞與相應抗體結合產生的細菌凝集或紅細胞凝集現象。可用於傳染病診斷如肥達氏反應(Widal reaction)診斷傷寒病。或利用血細胞凝集現象檢查血型。

間接凝集  是用可溶性抗原包被在乳膠顆粒或紅細胞表麵,與相應抗體混合出現的凝集現象。如用γ球蛋白包乳膠顆粒檢測類風濕關節炎病人血清中的類風濕因子,用甲狀腺球蛋白包被乳膠顆粒用於檢測甲狀腺球蛋的抗體。故凝集反應即可測定抗原,也可測抗體,方法簡便、敏感。

小結和展望

綜上所述,隨著生物醫學的發展,各種免疫學檢測手段日趨豐富,多種免疫檢測方法聯合正在成為新趨勢。但是目前許多檢測方法仍具有一定局限性,精確的、可靠的、快速的及低廉的檢測手段仍需探索設計。另外,一些免疫學檢測有待於臨床大規模試驗驗證,才能不斷地改良、完善。盡管免疫學檢測在發展過程中仍麵臨挑戰,但隨著免疫學機製的研究、生物學的發展和臨床調查的深入,免疫學檢測對各種疾病的早診斷、早幹預、早治療都具有重要意義。總的來說,疫學檢測的研究意義深遠的,同時有待於科學家發現更加有效的檢測方法。


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